HPLC- Ορισμός, Αρχή, Μέρη, Τύποι, Χρήσεις, Διάγραμμα

HPLC- Ορισμός, Αρχή, Μέρη, Τύποι, Χρήσεις, Διάγραμμα

September 30, 2022 0 Von admin

Τι είναι η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC);

Υψηλή απόδοση υγρή χρωματογραφία ή κοινώς γνωστή ως HPLC, είναι μια αναλυτική τεχνική που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό, την αναγνώριση ή την ποσοτικοποίηση κάθε συστατικού σε ένα μείγμα.

Το μείγμα διαχωρίζεται χρησιμοποιώντας τη βασική αρχή της στήλης χρωματογραφία και στη συνέχεια αναγνωρίστηκε και ποσοτικοποιήθηκε με φασματοσκοπία.

Στη δεκαετία του 1960, η χρωματογραφία στήλης LC με τις κατάλληλες γυάλινες στήλες χαμηλής πίεσης αναπτύχθηκε περαιτέρω στην HPLC με τις προσαρμοσμένες σε υψηλή πίεση μεταλλικές στήλες.

Η HPLC είναι επομένως βασικά μια εξαιρετικά βελτιωμένη μορφή υγρής χρωματογραφίας στήλης. Αντί ένας διαλύτης να αφήνεται να στάζει μέσα από μια στήλη υπό τη βαρύτητα, διοχετεύεται υπό υψηλές πιέσεις έως και 400 ατμόσφαιρες.

Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC)

Πηγή εικόνας: Sartorius AG.

Αρχή της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC)

  • Ο καθαρισμός λαμβάνει χώρα σε μια στήλη διαχωρισμού μεταξύ μιας στατικής και μιας κινητής φάσης.
  • Η στατική φάση είναι ένα κοκκώδες υλικό με πολύ μικρά πορώδη σωματίδια σε μια στήλη διαχωρισμού.
  • Η κινητή φάση, από την άλλη πλευρά, είναι ένας διαλύτης ή μίγμα διαλυτών που ωθείται σε υψηλή πίεση μέσω της στήλης διαχωρισμού.
  • Μέσω μιας βαλβίδας με συνδεδεμένο βρόχο δείγματος, δηλαδή ενός μικρού σωλήνα ή ενός τριχοειδούς από ανοξείδωτο χάλυβα, το δείγμα εγχέεται στη ροή κινητής φάσης από την αντλία στη στήλη διαχωρισμού χρησιμοποιώντας μια σύριγγα.
  • Στη συνέχεια, τα επιμέρους συστατικά του δείγματος μεταναστεύουν μέσω της στήλης με διαφορετικούς ρυθμούς, επειδή διατηρούνται σε διαφορετικό βαθμό από αλληλεπιδράσεις με τη στατική φάση.
  • Μετά την έξοδο από τη στήλη, οι μεμονωμένες ουσίες ανιχνεύονται από έναν κατάλληλο ανιχνευτή και μεταβιβάζονται ως σήμα στο λογισμικό HPLC στον υπολογιστή.
  • Στο τέλος αυτής της λειτουργίας/τρεξίματος, λαμβάνεται ένα χρωματογράφημα στο λογισμικό HPLC στον υπολογιστή.
  • Το χρωματογράφημα επιτρέπει την ταυτοποίηση και την ποσοτικοποίηση των διαφόρων ουσιών.

Όργανα του Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC)

Όργανα HPLC

Πηγή εικόνας: Εργαστηριακές Πληροφορίες.

Η αντλία

  • Η ανάπτυξη της HPLC οδήγησε στην ανάπτυξη του συστήματος αντλίας.
  • Η αντλία τοποθετείται στο ανώτερο ρεύμα του συστήματος υγρής χρωματογραφίας και παράγει μια ροή υγρού έκλουσης από τη δεξαμενή διαλύτη στο σύστημα.
  • Η παραγωγή υψηλής πίεσης είναι μια «τυποποιημένη» απαίτηση των αντλιών, εκτός από την οποία, θα πρέπει επίσης να είναι σε θέση να παρέχει σταθερή πίεση σε οποιαδήποτε κατάσταση και ελεγχόμενο και αναπαραγόμενο ρυθμό ροής.
  • Οι περισσότερες αντλίες που χρησιμοποιούνται στα τρέχοντα συστήματα LC δημιουργούν τη ροή με κίνηση εμπρός-πίσω ενός εμβόλου που κινείται με κινητήρα (παλίνδρομες αντλίες). Λόγω αυτής της κίνησης του εμβόλου, παράγει «παλμούς».

Εγχυνών

  • Δίπλα στην αντλία τοποθετείται ένας εγχυτήρας.
  • Η απλούστερη μέθοδος είναι η χρήση σύριγγας και το δείγμα εισάγεται στη ροή του εκλούτη.
  • Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος έγχυσης βασίζεται σε βρόχους δειγματοληψίας.
  • Η χρήση του συστήματος αυτόματης δειγματοληψίας (αυτόματος εγχυτήρας) χρησιμοποιείται επίσης ευρέως που επιτρέπει επαναλαμβανόμενες εγχύσεις σε καθορισμένο προγραμματισμένο χρονισμό.

Στήλη

  • Ο διαχωρισμός πραγματοποιείται εντός της στήλης.
  • Οι πρόσφατες στήλες συχνά προετοιμάζονται σε περίβλημα από ανοξείδωτο χάλυβα, αντί για γυάλινες στήλες.
  • Το υλικό συσκευασίας που χρησιμοποιείται γενικά είναι πηκτώματα πυριτίας ή πολυμερών σε σύγκριση με το ανθρακικό ασβέστιο.
    Το μέσο έκλουσης που χρησιμοποιείται για την LC ποικίλλει από όξινους έως βασικούς διαλύτες.
  • Το μεγαλύτερο μέρος του περιβλήματος στήλης είναι κατασκευασμένο από ανοξείδωτο χάλυβα, καθώς το ανοξείδωτο είναι ανεκτικό σε μεγάλη ποικιλία διαλυτών.

Ανιχνευτής

  • Ο διαχωρισμός των αναλυτών πραγματοποιείται μέσα στη στήλη, ενώ ένας ανιχνευτής χρησιμοποιείται για την παρατήρηση του ληφθέντος διαχωρισμού.
  • Η σύνθεση του υγρού έκλουσης είναι συνεπής όταν δεν υπάρχει αναλυτής ουσία. Ενώ η παρουσία της αναλυόμενης ουσίας αλλάζει τη σύνθεση του υγρού έκλουσης. Αυτό που κάνει ο ανιχνευτής είναι να μετρήσει αυτές τις διαφορές.
  • Αυτή η διαφορά παρακολουθείται ως μια μορφή ηλεκτρονικού σήματος. Υπάρχουν διάφοροι τύποι ανιχνευτών διαθέσιμοι.

Μηχάνημα εγγραφής

  • Η αλλαγή στο υγρό έκλουσης που ανιχνεύεται από έναν ανιχνευτή έχει τη μορφή ηλεκτρονικού σήματος και επομένως δεν είναι ακόμα ορατή στα μάτια μας.
  • Τα παλαιότερα χρόνια χρησιμοποιούνταν ευρέως το στυλό (χαρτί)-καταγραφέας χαρτών. Στις μέρες μας, ο επεξεργαστής δεδομένων (integrator) που βασίζεται σε υπολογιστή είναι πιο συνηθισμένος.
  • Υπάρχουν διάφοροι τύποι επεξεργαστών δεδομένων. από ένα απλό σύστημα που αποτελείται από τον ενσωματωμένο εκτυπωτή και τον επεξεργαστή κειμένου, ενώ αυτά με λογισμικό που είναι ειδικά σχεδιασμένο για σύστημα LC το οποίο όχι μόνο αποκτά δεδομένα αλλά διαθέτει χαρακτηριστικά όπως προσαρμογή κορυφής, διόρθωση γραμμής βάσης, αυτόματο υπολογισμό συγκέντρωσης, προσδιορισμό μοριακού βάρους κ.λπ. .

Degasser

Το υγρό έκλουσης που χρησιμοποιείται για την ανάλυση LC μπορεί να περιέχει αέρια όπως το οξυγόνο που δεν είναι ορατά στα μάτια μας.

  • Όταν υπάρχει αέριο στο υγρό έκλουσης, αυτό ανιχνεύεται ως θόρυβος και προκαλεί μια ασταθή γραμμή βάσης.
  • Το Degasser χρησιμοποιεί ειδική σωλήνωση πολυμερικής μεμβράνης για την αφαίρεση αερίων.
  • Οι πολυάριθμοι πολύ μικροί πόροι στην επιφάνεια του πολυμερούς σωλήνα επιτρέπουν στον αέρα να περάσει ενώ εμποδίζουν οποιοδήποτε υγρό να περάσει μέσα από τον πόρο.

Θερμαντήρας στήλης

Ο διαχωρισμός LC συχνά επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από τη θερμοκρασία της στήλης.

  • Προκειμένου να επιτευχθούν επαναλαμβανόμενα αποτελέσματα, είναι σημαντικό να διατηρείτε σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας.
  • Επίσης για ορισμένες αναλύσεις, όπως η ζάχαρη και το οργανικό οξύ, μπορούν να ληφθούν καλύτερες αναλύσεις σε υψηλές θερμοκρασίες (50 έως 80°C).
  • Έτσι οι στήλες διατηρούνται γενικά μέσα στον κλίβανο στήλης (θερμαντήρας στήλης).
Διάγραμμα HPLC
Διάγραμμα HPLC

Τύποι Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC)

  1. Κανονική φάση:

Η συσκευασία της στήλης είναι πολική (π.χ. πυρίτιο) και η κινητή φάση είναι μη πολική. Χρησιμοποιείται για ευαίσθητες στο νερό ενώσεις, γεωμετρικά ισομερή, ισομερή cis-trans και χειρόμορφες ενώσεις.

  1. Αντίστροφη φάση:

Η συσκευασία της στήλης είναι μη πολική (π.χ. C18), η κινητή φάση είναι αναμίξιμος διαλύτης με νερό+ (π.χ. μεθανόλη). Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για πολικά, μη πολικά, ιονίσιμα και ιοντικά δείγματα.

  1. Ανταλλαγή ιόντων:

Η συσκευασία στήλης περιέχει ιοντικές ομάδες και η κινητή φάση είναι ρυθμιστική. Χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό ανιόντων και κατιόντων.

  1. Εξαίρεση μεγέθους:

Τα μόρια διαχέονται σε πόρους ενός πορώδους μέσου και διαχωρίζονται ανάλογα με το σχετικό τους μέγεθος προς το μέγεθος των πόρων. Τα μεγάλα μόρια εκλούονται πρώτα και τα μικρότερα μόρια εκλούονται αργότερα.

Εφαρμογές Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC)

Η HPLC έχει εξελιχθεί σε μια μέθοδο καθολικής εφαρμογής, ώστε να βρίσκει τη χρήση της σε όλους σχεδόν τους τομείς της χημείας, της βιοχημείας και της φαρμακευτικής.

  • Ανάλυση φαρμάκων
  • Ανάλυση συνθετικών πολυμερών
  • Ανάλυση ρύπων στην περιβαλλοντική ανάλυση
  • Προσδιορισμός φαρμάκων σε βιολογικές μήτρες
  • Απομόνωση πολύτιμων προϊόντων
  • Καθαρότητα προϊόντων και ποιοτικός έλεγχος βιομηχανικών προϊόντων και εκλεκτών χημικών
  • Διαχωρισμός και καθαρισμός βιοπολυμερών όπως ένζυμα ή νουκλεϊκά οξέα
  • Καθαρισμός νερού
  • Προ-συγκέντρωση ιχνοστοιχείων
  • Χρωματογραφία ανταλλαγής προσδέματος
  • Ιονανταλλακτική χρωματογραφία πρωτεϊνών
  • Χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων υψηλού pH υδατανθράκων και ολιγοσακχαριτών

Πλεονεκτήματα της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC)

  1. Ταχύτητα
  2. Αποδοτικότητα
  3. Ακρίβεια
  4. Ευέλικτο και εξαιρετικά ακριβές όταν πρόκειται για τον προσδιορισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό χημικών συστατικών.

Περιορισμοί

  1. Κόστος: Παρά τα πλεονεκτήματά της, η HPLC μπορεί να είναι δαπανηρή, απαιτώντας μεγάλες ποσότητες ακριβών οργανικών ουσιών.
  2. Περίπλοκο
  3. Η HPLC έχει χαμηλή ευαισθησία για ορισμένες ενώσεις και ορισμένες δεν μπορούν να ανιχνευθούν καθώς απορροφώνται μη αναστρέψιμα.
  4. Οι πτητικές ουσίες διαχωρίζονται καλύτερα με αέρια χρωματογραφία.

βιβλιογραφικές αναφορές

  1. https://www.shodex.com/en/kouza/a.html
  2. https://www.alphacrom.com/en/hplc-basics
  3. https://laboratoryinfo.com/hplc/
  4. https://sciencing.com/disadvantages-advantages-hplc-5911530.html
  5. https://www.slideshare.net/krakeshguptha/hplc-26970638
  6. https://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html
  7. https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=8468
  8. https://www.ru.ac.za/media/rhodesuniversity/content/nanotechnology/documents/chromatography%20Augustus.pdf